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多家机构联合、多种蛋白组学联合发现 ALS患者组织3个前途潜在生物标志物

人阅读 发布时间:2020-03-27 10:18

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2019年11月,德国乌尔姆大医院神经内科联合几家机构在一区期刊Acta Neuropathologica (IF=18.174)发表题为“Proteomics in cerebrospinal fluid and spinal cord suggests UCHL1, MAP2 and GPNMB as biomarkers and underpins importance of transcriptional pathways in amyotrophic lateral sclerosis”的文章。利用iTRAQ+PRM+Label free的蛋白质组学技术,寻找到了3个很有前途的潜在ALS生物标志物,可能为患者的早期诊断和疾病进展过程的评估提供帮助。

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样本:脑脊液+脊髓组织

仪器:Q Exactive(Thermo Scientific)、QTRAP 6500(AB Sciex)

软件:MaxQuant、Skyline

发表期刊:Acta Neuropathologica

影响因子:18.174

技术手段:iTRAQ+PRM+Label free蛋白质组学

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研究背景

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肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种罕见且致命的神经退行性疾病,其特征是严重的运动神经元丧失,最后在3-5年内死于呼吸衰竭。目前ALS的诊断以临床症状为基础,妨碍了对患者症状前期的研究,不利于患者尽早诊疗。且只有5%的ALS患者有明确的单基因背景,散发ALS(sALS)的病因仍不清楚。而目前最有希望的ALS生物标记候选物是脑脊液(CSF)和血液中的神经丝,但它出现在有症状的疾病阶段,且在疾病进程中浓度水平不会改变。因此,迫切需要寻找新的ALS相关通路,弥补目前对ALS在病理生理学认识上的空白,为疾病治疗策略的改进提供新的靶点,并为早期诊断和疾病进展过程建立新的候选生物标记物,进一步帮助药物开发。


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研究思路

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实验结果

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一.脑脊液标本的蛋白质组学比较

为了在无症状ALS突变携带者和有症状的gALS和sALS中识别新的疾病途径和分析蛋白质改变水平,使用iTRAQ标记定量蛋白质组对对照组Con(n=16)、无症状ALS突变携带者Car(n=14)和sALS(n=12)和gALS(n=14)患者的脑脊液样本进行比较(临床资料见表1)。排除血液污染的样本(2个Con,1个Car,2个sALS,3个gALS),最终有1929个蛋白用于蛋白定量分析。
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表1 |脑脊液发现阶段(iTRAQ)和验证阶段(MRM)队列的临床资料

ALS:肌萎缩侧索硬化症,ALSFRS-ra:ALS功能评分修订值,Con:对照组,f:女性,gALS:遗传性ALS,LP lumbar puncure:腰椎穿刺,m:男性,sALS:散发性ALS

a 中位数和四分位数范围

b 卡方检验(性别)、Mann-Whitney检验(两组)或Kruskal-Wallis检验和Dunn's事后检验(两组以上)。

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将有症状的ALS患者(sALS+gALS)与对照组(Con)进行比较,筛选到32个显著差异蛋白(FDR=0.05)(表2)。


表2 |ALS患者脑脊液中的显著差异蛋白(FDR=0.05)

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在ALS((sALS+gALS))中,已建立的ALS标记NEFL、NEFH和CHIT1显著上调,而另一个神经退行性的生物标记物tau蛋白则没有改变,此结果与先前的研究相符,这表明我们的蛋白质组学能够很好的识别CSF样本与疾病相关的低丰度蛋白质。ALS患者(sALS+gALS)显著下调的3种蛋白质,均为组蛋白家族,另外显著上调的蛋白质有NEFL、NEFH 、NEFM、 CHIT1 、GPNMB、CHI3L1、CHI3L2、APOC2、APOC3(FDR<0.05)(图1a)。GO富集分析显示,显著差异蛋白为神经丝、核小体、中/高密度脂蛋白重塑、RNA聚合酶等与转录、核小体、细胞周期、脂质蛋白重塑途径相关的蛋白质(图1b)。

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图1 | ?iTRAQ标记定量蛋白组学揭示ALS患者脑脊液中的蛋白质差异效果

(a)比较ALS(sALS+gALS,n=22)和年龄及性别匹配的对照组(Con,n=14)脑脊液蛋白质表达水平的火山图;

(b)ALS CSF中显著差异蛋白的GO富集分析;

(C)ALS患者32个显著差异蛋白的聚类分析;

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二.应用PRM验证ALS(sALS + gALS)候选生物标志物
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作者采用PRM分析靶标蛋白(NEFM、GPNMB、MAP2、SERPINA3、UCHL1、CAPG和GBA)的生物标志物潜能。与对照组相比,确认了ALS(sALS+gALS)患者的脑脊液中NEFM、GPNMB、MAP2、UCHL1和CAPG含量显著上调,SERPINA3和GBA在两组间无显著性差异(图2)。发病年龄与GPNMB(r=0.52,p<0.001)、MAP2(r=0.30,p=0.04)、UCHL1(r=0.61,<0.001)和CAPG(r=0.40,p<0.001)显著相关,而与NEFM无关(r=0.28,p=0.05)。发病到腰椎穿刺的时长与GPNMB(r=-0.37,p<0.001)和MAP2(r=-0.30,p=0.04)呈显著负相关,但与其他蛋白质(UCHL1:r=-0.20,p=0.06,CAPG:r=0.01,p=0.95,NEFM:r=0.12,p=0.39)无显著相关。ALSFRS-r评分与GPNMB(r=-0.44,p<0.001),UCHL1(r=-0.25,p=0.02)和CAPG(r=-0.30,p=0.005)显著相关,但不包括MAP2(r=-0.22,p=0.13)和NEFM(r=0.01,p=0.97)。

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图2 | 候选生物标志物的PRM分析

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为了评估生物标志物的预后价值,我们进行了患者的生存时间分析。GPNMB与生存时间呈显著负相关,但UCHL1、CAPG、MAP2和NEFM则无显著相关性(图3a)。脑脊液中GPNMB水平高于中位数的ALS患者的生存时间明显短于低GPNMB水平的患者(图3b、3c)。

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图3 |ALS患者CSF-GPNMB水平升高与生存期缩短有关

(a)验证队列(n=46)中一部分gALS和sALS患者的CSF-GPNMB蛋白质含量与从LP到死亡时间的相关分析(Spearman)。CSF-GPNMB蛋白质含量低于或高于中位浓度的ALS患者的(b)Kaplan-Meier曲线和(c)箱型图显示,GPNMB水平高的ALS患者生存期较短。

(b)log-rank检验,p=0.006;

(c)Mann-Whitney检验,**p=0.002。

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三.无症状ALS突变携带者与对照者的蛋白质组比较
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将无症状ALS突变携带者的CSF蛋白质组与对照组进行比较,两组之间的无显著差异(FDR<0.05,图4)。
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图4 | 无症状ALS突变携带者脑脊液蛋白质组无显著变化

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为了确定在疾病发生前可能逐渐改变的蛋白质,我们将无症状ALS突变携带者的蛋白质水平与疾病发生的预期时间进行关联分析,发现16种蛋白质与预期发病时间呈显著相关(Spearman r>0.5或<-0.5和p<0.05)(表3)。
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表3 |无症状ALS突变携带者中与预期发病时间显著相关蛋白

AD:阿尔茨海默病;

ALS:肌萎缩侧索硬化;

MS:多发性硬化症;

FTLD:多发性硬化症;

PD:帕金森病;

SCA:小脑萎缩症;95%CI:95%置信区间。


四.死者脊髓组织蛋白质组分析


使用Label-free蛋白质组学技术对ALS(n=8)和对照组(n=7)的死者脊髓组织进行比较。排除血液污染样本及一些不合格数据后,确定了5115个蛋白质,ALS中公有292个蛋白质发生显著变化(139个下调,153个上调,FDR=0.05),包括ALS相关蛋白,如APOE、hnRNPA2b1、LMNB1、NEFH、NEFL、NEFM、PRPH、SARM1和SOD2。
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图5 | Label free蛋白质组学技术揭示脊髓组织中的蛋白质差异

(a)比较ALS(sALS+gALS,n=8)和对照组(Con,n=7)死后脊髓组织蛋白质表达水平的火山图。

(b)292个显著差异蛋白质的聚类分析。

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表4列出了前30种显著差异蛋白,其中参与mRNA剪接、催化步骤2剪接体和神经丝的蛋白质在变化的蛋白质组中显著富集。基于292个差异调节蛋白,分级聚类确定了两个主要的聚类(图5b)。聚类1包含7个对照组中的6个(86%),聚类2包含所有ALS患者(100%)。

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表4 |ALS(sALS+gALS)患者死后脊髓组织中差异变化前30位的蛋白

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五.联合分析脑脊液与脊髓组织蛋白质组学数据
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据联合分析结果,可将脑脊液和脊髓组织中的1049个蛋白分为四组:(1)脊髓组织中表达下调,脑脊液中表达上调;(2)两者均表达上调;(3)脊髓组织中表达上调,脑脊液中表达下调;(4)两者均下调。其中,组(2)富含与补体和凝血级联和ECM受体相互作用有关的蛋白质,组(3)富含核小体和核小体的蛋白质。组(1)有神经丝和其他细胞骨架蛋白,但组(1)和组(4)没有显著富集。

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图6 | 脑脊液和脊髓组织蛋白质组数据的联合分析

白分为四类:

(1)在脊髓组织中下调和脑脊液上调,包括神经丝蛋白(蓝色);

(2)两者均上调(红色);

(3)脊髓组织中上调和脑脊液下调(绿)和(4)两者均下调(粉色)。

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实验结论

通过利用iTRAQ、PRM和Label free三种蛋白质组学技术对ALS患者脑脊液和脊髓样本蛋白组数据进行研究,发现UCHL1、MAP2和GPNMB有潜力作为ALS新的生物标志物。同时,无症状ALS突变携带者脑脊液中缺乏显著的蛋白质组变化支持了ALS临床前阶段较短的事实。

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文章利用蛋白质组学手段研究鉴定ALS的潜在生物标志物簇。首先利用iTRAQ标记定量蛋白质组学技术检测发现队列脑脊液中蛋白质,筛选出显著差异蛋白。再利用PRM靶向蛋白质组学技术验证发现队列脑脊液中的显著差异蛋白,同时利用Label free非标记定量蛋白质组学技术检测脊髓组织中显著差异蛋白。最后作者将脑脊液和脊髓组织样本中的显著差异蛋白进行联合分析,发现了3个非常有价值的潜在ALS鉴定生物标志物簇。本文联合利用iTRAQ、PRM和Label free三种蛋白质组学手段去分别分析两种样本(脑脊液和脊髓组织)中的差异蛋白,十分值得借鉴。

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文末看点

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运用多种技术联合研究的科研案例在不断地刷新着投稿期刊的高度,特别是在疾病的早期诊断和疾病进展评估中。鹿明生物自2017年初建立了蛋白组学技术平台(iTRAQ/TMT、DIA、PCT-DIA、PRM、修饰蛋白组),是国内早期开展多种联合分析蛋白组学研究机构,目前鹿明生物也推出了蛋白组学检测+验证一体化--1+1>2的蛋白组学黄金组合服务:DIA +PRM技术,满24个样本,为您立即省18000?。详情请戳【活动】新一代质谱检测DIA技术 ×WB替代技术的强力联合

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参考文献

Patrick?Oeckl, Patrick?Weydt, Dietmar?R.?Thal et al. Proteomics in cerebrospinal fluid and spinal cord suggests UCHL1, MAP2 and GPNMB as biomarkers and underpins importance of transcriptional pathways in amyotrophic lateral sclerosis [J]. Acta Neuropathologica,2020,139(1):119-134.

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